[분자생명공학] 복제동물의 제조 (1)

1. 일란성 쌍둥이(Monozygotic twins)

하나의 수정란이 정상적으로 분열하지 않고, 2개의 수정란으로 분리되어 각각 따로 따로 그러나 정상적으로 분열하는 경우를 말한다. 가장 이른 분리는 2-cell stage일 때로 추정되며, 일반적으로는 early blastocyst stage에서 분리된다.

- Cavity(공동) : 염증이 생기거나 괴사가 일어나는 등 여러 원인에 의해 장기의 조직이 붕괴되어 밖을 나오거나 흡수되어진 공간

- Blastocyst(배반포) : 난자와 정자가 결합된 하나의 세포(수정란)가 세포분열을 통해 여러 개의 세포로 구성된 것

- Blastocyst cavity(포배강) : Blastocoele, 하나로 연결된 세포덩어리(영양배엽 : trophoblast)에 의해 형성된 공동

- Inner cell mass(내세포집단) : 미분화 배아세포의 포배강 내에 형성되는 동물극 세포집락으로, 이 30-40개의 세포군집이 세포분열(증식), 분화되어 배아(embryo)를 형성

- Amniotic cavity(양막강) : ICM과 바깥쪽 세포층(영양배엽) 사이에 형성되는 공동

- Yolk sac(난황낭) : 동물배에서 난황덩이를 싸는 배체외배층으로 구성된 낭상구조물(영양원 저장)

​

>> 이란성 쌍둥이(Dizygotic twins)

2개의 난모세포(oocyte) + 2개의 정자(sperm)로 형성되며, 서로 다른 유전 형질을 갖는다.

​

2. 수정란 분할법, 할구분리법

- 수정란 분할 : 4 또는 8 세포기에 있는 수정란을 예리한 도구로 분리

- 할구 분리 : 수정란 속의 할구(수정란의 난할을 통해 생성되는 세포)들을 물리, 화학적으로 분리

☞ 분리된 세포들을 체외배양 후 대리모에 이식하여 임신시키면 동일유전 형질을 갖는 개체가 탄생한다. 이는 진정한 의미의 복제가 아니며, 태어난 개체의 상태도 좋지 않다.

​

3. 생식세포핵이식법

1) 핵을 제거(탈핵)한 난자(recipient)(세포활성화 과정을 거친 metraphase Ⅱ 단계의 수핵난자)를 준비한다.

2) 16 또는 32 세포기의 수정란을 체외로 채취한다. (채란)

3) pronase(단백질 분해효소)를 이용하여 외막(투명대)를 제거하고 각 할구들의 결합을 이완시켜서 얻은 동일한 유전정보를 가진 16 또는 32개의 세포(donor)에서 S 또는 G2단계의 핵(공핵, donor nuclei)을 추출한다.

4) recipient에게 donor에서 추출한 핵을 이식한다.

5) 핵 이식 수정란에 전기자극(electrical current) 등을 처리하여 세포융합(cell fusion) 한 후에 인큐베이터에 7-8일 배양하면 16 또는 32세포기의 수정란(복제수정란)이 만들어진다.

☞ 이론적으로 위 과정을 반복하면 하나의 수정란으로부터 무한한 복제수정란을 만들어 낼 수 있다.

​

4. embryonic stem cell을 이용한 동물복제

Blastocyst의 Inner cell mass에서 유래된 ES cell의 핵을 donor nucleus(공핵)로 이용하는 방법이다. Stem cell은 인간의 몸을 구성하는 서로 다른 세포나 장기로 성장하는 일종의 모세포로 줄기세포 또는 간세포라고 한다. 사람의 배아를 이용하여 만들 수 있는 배아줄기세포(ES cell, 배아줄기세포, 복수기능줄기세포, 전능세포) 또는 혈구세포를 끊임없이 만드는 골수세포와 같은 성체줄기세포(Adult stem cell, 다기능 줄기세포)가 있다.

​

5. 체세포 복제를 이용한 동물복제

체세포(비생식세포)를 이용하여 유전적으로 동일한 개체를 복제하는 것을 말한다.

​

>> 역분화 만능 줄기세포(Induced pluripotent stem cell)

이미 분화된 세포의 시계를 되돌려서(reprogramming) 분열 및 분화가 정지된 상태인 G0기로 조절하는 과정을 역분화(Dedifferentiation)라고 말한다. 역분화 만능 줄기세포는 만능분화능(pluripotency)을 가지고 않던 분화된 세포들이 인위적으로 역분화과정을 통해 만능분화능을 가지도록 유도된 것을 말한다. 역분화는 체세포가 영양이 족한 상테에서 배양되어 진행된다. IPS cell과 ES cell의 유사점은 다음과 같다.

1) 세포의 모양(둥근모양, 큰 핵과 인, 적은 세포질)과 성장속도

2) 유전자 발현과 염색체 변형 패턴

3) 만능분화능

4) 면역결핍의 생쥐에서 teratoma 형성

5) 생쥐의 Blastocyst에 삽입시 키메라(chimera) 생쥐 발현

6) 유전자의 생식선 정이 가능

IPS cell의 장점은 다음과 같다.

1) 환자면역 적합형 세포치료제를 개발할 수 있다.

2) 난자나 배아를 사용하지 않기 때문에 종교적, 생명윤리적 논쟁을 피할 수 있다.

3) 환자의 체세포로 IPS 세포를 만들어 분화시키면 질병의 원인규명이나 치료방법 연구가 용이해진다.

​

>> 돌리

사람이나 동물을 구성하는 세포는 발생 생물학적 기분으로 보면 난자, 정자, 수정란 등과 같은 생식세포와 그 외의 비생식세포(체세포)로 구분할 수 있다. 복제양 '돌리'가 태어나기전까지는 동물의 복제는 생식세포를 통해서만 가능한 것으로 생각되어왔다. 그러나 Lan Wilmut 박사는 일반 체세포인 임신 후반기의 양의 유방세포에서 핵을 분리하여, 이를 혈청농도의 점진적 감소 등의 조치로 G0상태에 머물게 하여 활성을 중지시켰다. Metraphase (중기) Ⅱ 단계의 핵이 제거된 수핵난자에 핵이식법에 의해 수정란으로 발육시키고 대리모에 임신시켜 돌리가 탄생되었다. 돌리는 6마리의 새끼를 낳아 완전한 생식능력을 갖는 생명체임이 증명되었다.

- 클로닝 과정

1) 핀 도셋 종 양으로부터 젖샘의 상피세포를 분리한다.

2) 세포가 분열하는데, 영양분을 제거하면 비활성 상태로 변함을 이용하여 세포를 휴면상테로 유도한다.

3) 블랙 페이스 종 양으로부터 난자를 채취하고 핵을 제거한다.

4) 전기융합을 통해 젖샘세포의 핵을 미수정란에 이식한다.

5) 난자가 분열하여 상실기나 포배기에 이르면 대리모의 자궁에 이식한다.

6) 임신기간을 거치면 젖샘세포를 제공한 양과 동일한 유전정보를 가진 클론이 태어난다.

- 실험상의 문제점

1) 277회의 동일한 시도에서 단 한 번 성공하였다.

2) donor인 암양으로부터 유선세포를 분리할 때 임신한 상태였기 때문에 분리한 체세포가 사실은 stem cell로부터 유래되었을 가능성이 있을 수 있다.