[분자생명공학] 유전자치료(Gene therapy)

치료유전자 또는 유전물질을 환자의 세포 안으로 주입시켜 윤전적 결함(AIDS 같은 후천성 질병, FM이나 ASA 같은 선천성 유전병)을 치료하거나 새로운 기능을 추가시키는 것을 유전자 치료라고 한다. 이를 위해서는 선행되어져야 할 3가지 연구가 있다. 원인 유전자 규명, 질병유전자 분석 및 발현 조절 기작 연구, 윤전자 전달방법이 그것이다.

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>> 유전자 전달 방법(Methods for gene delivery)

1. 화학적 방법(chemical methods)

1) Calcium-phosphate transfection (인산칼슘형질주입)

- 1973년 Graham과 Van der Eb에 의해 개발되어 많은 동물세포의 유전자 전달에 사용되어진 방법으로, 작고 비수용성인 인산칼슘 침전들이 세포의 표면에 흡수되어 endocytosis를 통해 세포 내로 들어가게 된다. 세포의 종류의 크기 그리고 침전물의 품질에 따라 차이를 보이지만 50%정도의 발현효율을 보인다.

- Low transduction efficiency(발현효율), Low integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

2) DEAE-dextran transfection(DEAE-덱스트란 형질주입)

- DNA를 세포로 전달하는 최초의 화학적 방법으로, 1965년 바이러스가 세포의 infection할 때 DEAE-dextran을 처리하였을 때 더 잘 되는 것을 보고 알려졌다.

- Low transduction efficiency(발현효율), Low integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

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2. 물리적 방법(physical methods)

1) Electroporation(전기천공법)

- 세포에 전기장을 가하여 막의 투과성을 증가하고 DNA를 세포 내에 도입하는 방법

- Low transduction efficiency(발현효율), Low integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

2) Microinjection(미세주입법, 현미주입법)

- 끝을 가늘게 만든 미소유리관을 세포 내에 자입하여 세포 내 등으로 시료를 직접 주입하는 방법으로, 압력에 의한 압미소주사법과 전기에 의한 미소전기영동법이 있다.

- High transduction efficiency(발현효율), Low integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

3) Particle bombardment(유전자총법)

- 금 또는 텅스텐(tungsten)의 가는 입자의 표면에 DNA를 응집시켜 헬륨가스압력 등을 이용하여 세포 내에 쏘아 넣어 세포에 DNA를 도입한다.

- High transduction efficiency(발현효율), Low integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

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3. 접합방법(fusion methods)

1) Liposomes

- 리포솜이라는 인공막과 DNA 복합체를 만들게 하는 구조와 융합시키는 방법

- Low transduction efficiency(발현효율), Low integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

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* 리포솜(Liposome)

- 인지질을 수용액에 현탁할 때 생기는 소포로, Cationic lipid(양이온 성질의 지방)과 Co-Lipid로 구성되어있다. 지질이중층으로 구성된 막에 의해 외막과 격리되어있으며, 콜레스테롤 당지질 등의 지질이나 막단백질을 막내에 이입시키는 것도 가능하다. 내ㅐ포된 수용액층에 이온, 저분자물질, 핵산, 단백질 등을 포획할 수 있다. DNA, mRNA 등을 내포한 리포솜이 유전정보의 매개체로서 주목된다. 리포솜은 구조 변경이 용이하며, 구조와 성분을 달리하여 전혀 새로운 물성과 기능, 용도가 제공된다. 또한 리포좀은 생체적합성과 분해성, 안정성의 뛰어남과 바이러스 감염 가능성이 없고, 다양한 크기의 유전자 도입이 가능하다는 장점을 가진다. 이러한 장점으로 인해 리포솜은 수없이 많은 물질의 전달물질로 광범위하게 이용되고 있다. 단 도입유전자의 발현이 일시적이다.

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>> 리포솜이 물질전달에 유용한 이유

1) 물질(DNA)를 둘러싸서 보호하기 때문에 혈중 내 효소 등에 의해 파괴되는 것을 막는다.

2) 원상태로는 세포 내로 들어가기 힘든 물질(DNA)를 세포내로 끌고 갈 수 있다.

3) 약물방출이 지연되도록 조절하는 일종의 DDS역할을 할 수 있다.

4) 표적리포솜으로 표적 약물의 효과를 극대화하고 부작용은 최소화할 수 있다.

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4. 수용체 매개 세포이물 흡수(receptor-mediated endocytosis)

- 단백질 등 세포 외 물질(배위자)이 세포막 표면에 있는 특이적인 수용체와 복합체를 형성하여 선택적으로 세포 내로 이동하는 방법

1) DNA-protein complexes(DNA 단백질 복합체)

- High transduction efficiency(발현효율), Low integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

2) Viral envelope/capsid-DNA complexes(바이러스막/캡시드-DNA 복합체)

- High transduction efficiency(발현효율), Low integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

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5. 재조합바이러스(recombinant viral vector)

- 바이러스 벡터 시스템, 가장 큰 가능성이 있는 임상의 적용된 방법이다. 바이러스의 유전자 중 해로운 것을 제거하고 치료유전자를 삽입한 Viral vector를 감염시키는 방법으로, 유전자를 세포 내부 염색체 안으로 삽입 가능하기 때문에 장기적인 발현이 이루어질 수 있다. 1990년 Adenosine deaminase deficiency 치료에 처음으로 적용되었다. Murine leukemia virus(MnLV)를 이용한 Retrovirus 벡터 연구가 활발하다.

1) Adeno virus(아데노바이러스)

- 대부분 불현성 바이러스며, 발병하더라도 자연치유가 가능하고 재감염에 대해 바이러스형 특이적 면역을 남긴다. 선형 이중 가닥의 DNA를 게놈으로 갖는 바이러스로 분열하는 세포 뿐 아니라 분열하지 않는 세포 모두에 감염이 가능하다. 일반적으로 숙주염색체 내로 삽입되지 않고, 핵 내에서 episomal element로 복제된다.

- High transduction efficiency(발현효율), Low integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

- 특징 : Ad5의 게놈은 36kb의 직선형 이중가닥 DNA로 8개의 전사단위로 구성되어있는데, 조절단백질을 발현하는 초기 유전자(early gene)와 구조단백질을 발현하는 말기유전자(late gene)로 나뉜다. 염색체 양 말단에는 말단반복염기서열(inverted teminal repeats, ITR)이 있어서 복제 개시 부위의 역할을 하며, 왼쪽 ITR에 뒤이어 바이러스 게놈의 포장에 관여하는 Φ염기서열이 존재한다. 아데노바이러스는 매우 높은 농도로 얻을 수 있고 분화가 끝난 세포에도 효과적으로 감염시킬 수 있어 유용하다.

- 장점 : 유전자 전달 효율이 높으며 세포의 분열상태와 무관하게 유전자 발현이 가능하고 상당히 농축된 Virus를 얻을 수 있기에 많은 세포로 감염이 가능하다.

- 단점 : 거의 모든 세포에 감염이 가능하기 때문에 주변의 정상세포에 대해 독성을 나타낼 수 있으며, 숙주 염색체 내로 삽입되지 않아 장기간의 유전자 발현이 불가능하다. 또한 대부분의 사람들이 이미 자연에 존재하는 아데노 바이러스에 노출되어 그에 대한 항체를 가지고 있을 것이다. (그러나 아데노 바이러스는 세포사를 촉진하거나 면역반응을 조절하는 유전자를 암세포로 전달한다.)

2) Adeno-associated virus(AAV)(아데노 관련 바이러스)

- 아데노 부속 바이러스는 단일가닥의 DNA 바이러스로서 단독으로 자기증식능력을 갖지 못하여, 아데노 바이러스나 백시니아(vaccinia) 혹은 헤르페스 바이러스 등의 도움 바이러스(helper virus)와 공존해야 하는 결함 바이러스이다.

- High transduction efficiency(발현효율), High integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

- 특징 : 아데노 부속 바이러스 게놈은 4681bp의 DNA로 양 끝에 145bp의 ITR을 갖는데, 이는 복제와 포장 그리고 rescue에 요구되는 최소 염기소열이다. ITR 내부에는 2개의 ORF가 있는데, 이는 복제에 요구되는 rep. 그리고 구조단백질을 코팅하는 cap유전자이다.

- 장점 : 다양한 세포에 효율적으로 감염시킬 수 있고, 아데노바이러스처럼 면역반응을 유도하지 않아 유전자 치료에 적합하다.

- 단점 : 이 벡터 개발에 있어서 주된 한계점은 포장할 수 있는 유전자의 크기 제한으로 4kb미만의 유전자만 사용가능하며, 벡터제조가 어렵고, 재조합 벡터의 경우 염색체의 특정 위치에 삽입되는 능력을 잃을 수 있다는 점과 분열하지 않는 세포에 삽입된 확률이 크게 낮아진다는 단점을 가진다.

3) Herpes simplex virus(HSV)(단순포진바이러스)

- 특징 : 단순헤르페스바이러스는 용균성(lytic) DNA바이러스로 중추신겨예에 선택적으로 감염하고 신경세포에 일생동안 잠복 감염할 수 있다는 독특한 특징을 가지고 있기 때문에 신경성 질환의 치료를 목적으로 개발되고 있다. 헤르페스 심플렉스 바이러스가 임상 시험에 사용되기 위해서는 잠복감염의 능력은 유지하면서 용균소 생성능력이 제거되고 자가복제 할 수 없도록 제조되어야 하는데, 헤르페스 심플렉스 바이러스는 70개가 넘는 유전자를 가지고 있는 매우 복잡한 바이러스이기 때문에 이는 결코 단순한 작업이 아니다.

- Low transduction efficiency(발현효율), Low integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

- 장점 : 헤르페스 심플렉스 바이러스 벡터는 중추신경계 암세포의 선택적인 파괴를 위한 벡터 시스템으로도 사용될 수 있으며, 보다 안전한 벡터가 개발된다면 신경계와 고나련된 질병을 치료할 수 있는 주요한 유전자전달법이 될 수 있을 것이다.

4) Human immunodeficiency virus(HIV)(인간면역결핍 바이러스)

- AIDS virus, RNA사슬구조이며 역전사 효소 등을 포함하는 내부의 핵심과 외부의 피막으로 구성되어있다. LTR에서는 각각 핵심단백질, 단백질가수분해효소, 역전사효소, 인테그레이즈, 외피단백질을 코드하고 있는 gag, pol, env(기본유전자)가 존재한다.

- High transduction efficiency(발현효율), High integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

5) Moloney murine leukemia virus(MoMLV)(몰로니 생쥐 백혈병 바이러스)

- 생쥐 백혈병에서 분리한 동종지향성 바이러스로, 이 바이러스를 신생 생쥐에 접종하면 흉선종을 수반하는 T세포 유래 림프구성 백혈병이 야기된다.

- High transduction efficiency(발현효율), High integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

6) Vaccinia virus(우두바이러스)

- 6염기쌍의 2중가닥 DNA로, 입자 중에는 RNA 폴리머라아제, 뉴틀레오타이드 가수분해효소가 존재하고 저온에서 안정적이다.

- High transduction efficiency(발현효율), Low integration efficiency(염색체 내 삽입효율)

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>> 유전자 전달 시스템 개발 시 고려사항

1) 효과적으로 세포 내로 삽입되어야 한다.

2) 적정기간에 걸쳐서 발현이 되어야 한다.

3) 환자에게 무해하여야 한다.

4) 넓은 범위의 치료유전자를 사용할 수 있어야 한다.

5) 투여량에 따른 치료효과 수준이 확립되어야 한다.

6) 임사에서 다루기 쉬운 형태로 공급되어야 한다.

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>> 조직세포 내로의 치료유전자 삽입

1) 치료유전자를 가진 바이러스 벡터가 특정세포의 receptor를 인지한다.

2) 세포표면이 receptor를 인식하고 바이러스 벡터가 세포 내로 들어간다.

3) 세포 내에서 바이러스 벡터는 핵산을 방출시킨다.

4) 치료 유전자가 핵안으로 들어가 세포내의 chromosome 상에 삽입된다.